Эктопический синтез белков (генотерапия) - История изменений

Zabava: /* Эритропоэтин */

2014-03-31T13:02:55Z

‎Эритропоэтин

Febor: Новая страница: «{{Клинфарм1}} == Эктопический синтез белков == Недостаток ростовых факторов и пептидных го…»

2014-02-18T20:24:43Z

Новая страница: «{{Клинфарм1}} == Эктопический синтез белков == Недостаток ростовых факторов и пептидных го…»

Новая страница

{{Клинфарм1}}
== Эктопический синтез белков ==

Недостаток ростовых факторов и пептидных гормонов в крови можно компенсировать путем эктопической экспрессии соответствующих генов. Этот подход требует доставки генов в ткани, которые в норме не синтезируют этот белок. В экспериментах и в первых клинических испытаниях таким способом удалось добиться экспрессии факторов свертывания (факторов VIII и IX), факторов роста (ИФР-1, эритропоэтина) и пептидных гормонов (СТГ, соматолиберина). В одних случаях необходима постоянная эктопическая секреция белка (например, фактора IX), в других — ген должен находиться под жестким контролем (например, ген эритропоэтина).

Чаще всего для эктопического синтеза белка используют скелетные мышцы (MacColl et al., 1999). Эта ткань обладает большой и постоянной клеточной массой, в нее легко делать инъекции. В нескольких доклинических исследованиях с помощью вирусных векторов и невирусных способов доставки генов удалось добиться трансфекции клеток скелетных мышц при незначительном побочном действии.

Метод эктопического синтеза белка имеет много преимуществ. В целом этот подход более дешев и удобен, чем введение рекомбинантных белков или концентратов, полученных из плазмы. При эктопическом синтезе существенно снижается риск инфекций, передающихся с кровью (таких, как гепатиты и ВИЧ-инфекция), что важно, например, для лечения гемофилии. В экспериментах этот подход был успешно применен для лечения гемофилии, карликовости и хронической анемии (см. ниже).

=== Фактор IX ===

Причиной гемофилий А и В является недостаточность факторов VIII и IX соответственно. Исследования, проведенные на мышах и собаках с гемофилией, показали, что трансфекция с помощью аденоассоциированного вектора приводит к устойчивому синтезу фактора IX в скелетных мышцах и улучшает состояние животных (Herzog et al., 1999). Описан и первый опыт применения в клинике аденоассоциированного вектора, содержащего ген фактора IX и промотор сверхранних генов цитомегаповируса, для лечения тяжелой гемофилии В (Kay et al., 2000). В этом исследовании обнаружено некоторое увеличение концентрации фактора IX в крови и снижение потребности во введении экзогенного фактора IX в небольшой группе больных. По-видимому, улучшения экспрессии гена можно добиться с помощью других промоторов, например последовательностей, содержащих энхансер и промотор из мышечной ткани (Hagstrom et al., 2000).

=== Эритропоэтин ===

Недостаточность эритропоэтина обычно наблюдается при ХПН. Больным, находящимся на диализе, для поддержания достаточного гематокрита необходимы частые инъекции эпоэтинов. Основной недостаток такого лечения — его высокая стоимость. В экспериментах показана возможность индукции эктопического синтеза эритропоэтина в скелетных мышцах (Tripathy et al., 1996) или коже (Klinman et al., 1999). Для этого в/м или внутрикожно вводили плазмидную ДНК или вирусный вектор, содержащие ген эритропоэтина человека и активный промотор, например промотор сверхранних генов цитомегаловируса. У экспериментальных животных на протяжении нескольких месяцев после инъекции были повышены сывороточная концентрация эритропоэтина и гематокрит.

В норме секреция эритропоэтина почками жестко регулируется, поэтому желательно контролировать и эктопический синтез этого белка. Такая система регуляции (рис. 5.6) была разработана на основе искусственного фактора транскрипции, регулируемого сиролимусом (ра-памицином) (Ye et al., 1999). Сиролимус — это иммунодепрессант для приема внутрь (гл. 53), взаимодействующий с двумя белками: РК506-связывающим белком-12 (FKBP12) и РКВР12-рапамицин-ассоциированным белком. Индуцируемая система экспрессии эритропоэтина содержит три молекулярных компонента: 1) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка р65-субъединицы фактора транскрипции NFkB и РКВР12-рапамицин-связывающего участка FKBP12-pa-памицин-ассоциированного белка, 2) химерный белок, состоящий из ДНК-связывающего участка и FKBP12, и 3) трансген, экспрессия которого регулируется искусственным фактором транскрипции. Сиролимус взаимодействует с FKBP12 и с РКВР12-рапамицин-связывающим участком и тем самым связывает первый химерный белок со вторым — образуется активный фактор транскрипции, который дозозависимо стимулирует экспрессию трансгена. Синтез эритропоэтина в скелетных мышцах происходит только в присутствии сиролимуса, который можно принимать внутрь. Этот подход использовали в экспериментах на мышах с нормальным иммунитетом и на макаках-резус, которым в/м вводили два адено-ассоциированных вектора, кодирующих различные компоненты системы.

Рисунок 5.6. Регуляция экспрессии гена с помощью сиролимуса (рапамицина). В верхней части рисунка показаны: 1) вектор, содержащий нужный трансген, транскрипция которого контролируется промотором, 2) химерный белок, состоящий из ДН К-связывающего участка фактора транскрипции и FKBP12 (см. текст), 3) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка фактора транскрипции и FKBP12-pana-мицин-связывающего участка РКВР12-рапамицин-ассоцииро-ванного белка (см. текст), 4) сиролимус. Сиролимус обеспечивает сборку фактора транскрипции, который активирует РНК-по-лимеразу и запускает транскрипцию. FRB — РКВР12-рапами-цин-связывающий участок РКВР12-рапамицин-ассоциирован-ного белка.

=== Другие факторы роста и гормоны ===

Продолжительную регулируемую экспрессию человеческого СТГ удалось получить у мышей после в/м инъекции аденоассоциированного вектора, содержащего соответствующий ген (Rivera et al., 1999). В этих экспериментах использовали регулируемую сиролимусом систему, описанную выше. Сиролимус вызывал значительное дозозависимое повышение концентрации человеческого СТГ в сыворотке мышей примерно через 3 ч после инъекции. Эта концентрация достигала максимума примерно через сутки. Эктопический синтез соматолиберина в мышцах был получен у свиней после в/м инъекции плазмидной ДНК, кодирующей этот пептид под контролем промотора а-актина из скелетных мышц (Draghia-Akli etal., 1997; Draghia-Akli et al., 1999).

В клетках скелетных мышц был получен также эктопический синтез ИФР-1, необходимого для развития этих мышц и других тканей. У мышей в/м инъекция аденоассоциированного вектора, содержавшего ген ИФР-1, приводила к стойкому (на протяжении 27 мес) увеличению мышечной массы и мышечной силы (Barton-Davis et al., 1998). Инъекция препятствовала возрастным изменениям мышечной ткани, что в перспективе позволит использовать этот метод для предотвращения преждевременного старения мышц.

@@ Строка 13: / Строка 13: @@
 === Эритропоэтин ===
 Недостаточность эритропоэтина обычно наблюдается при ХПН. Больным, находящимся на диализе, для поддержания достаточного гематокрита необходимы частые инъекции эпоэтинов. Основной недостаток такого лечения — его высокая стоимость. В экспериментах показана возможность индукции эктопического синтеза эритропоэтина в скелетных мышцах (Tripathy et al., 1996) или коже (Klinman et al., 1999). Для этого в/м или внутрикожно вводили плазмидную ДНК или вирусный вектор, содержащие ген эритропоэтина человека и активный промотор, например промотор сверхранних генов цитомегаловируса. У экспериментальных животных на протяжении нескольких месяцев после инъекции были повышены сывороточная концентрация эритропоэтина и гематокрит.
@@ Строка 18: / Строка 19: @@
 В норме секреция эритропоэтина почками жестко регулируется, поэтому желательно контролировать и эктопический синтез этого белка. Такая система регуляции (рис. 5.6) была разработана на основе искусственного фактора транскрипции, регулируемого сиролимусом (ра-памицином) (Ye et al., 1999). Сиролимус — это иммунодепрессант для приема внутрь (гл. 53), взаимодействующий с двумя белками: РК506-связывающим белком-12 (FKBP12) и РКВР12-рапамицин-ассоциированным белком. Индуцируемая система экспрессии эритропоэтина содержит три молекулярных компонента: 1) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка р65-субъединицы фактора транскрипции NFkB и РКВР12-рапамицин-связывающего участка FKBP12-pa-памицин-ассоциированного белка, 2) химерный белок, состоящий из ДНК-связывающего участка и FKBP12, и 3) трансген, экспрессия которого регулируется искусственным фактором транскрипции. Сиролимус взаимодействует с FKBP12 и с РКВР12-рапамицин-связывающим участком и тем самым связывает первый химерный белок со вторым — образуется активный фактор транскрипции, который дозозависимо стимулирует экспрессию трансгена. Синтез эритропоэтина в скелетных мышцах происходит только в присутствии сиролимуса, который можно принимать внутрь. Этот подход использовали в экспериментах на мышах с нормальным иммунитетом и на макаках-резус, которым в/м вводили два адено-ассоциированных вектора, кодирующих различные компоненты системы.
-Рисунок 5.6. Регуляция экспрессии гена с помощью сиролимуса (рапамицина). В верхней части рисунка показаны: 1) вектор, содержащий нужный трансген, транскрипция которого контролируется промотором, 2) химерный белок, состоящий из ДН К-связывающего участка фактора транскрипции и FKBP12 (см. текст), 3) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка фактора транскрипции и FKBP12-pana-мицин-связывающего участка РКВР12-рапамицин-ассоцииро-ванного белка (см. текст), 4) сиролимус. Сиролимус обеспечивает сборку фактора транскрипции, который активирует РНК-по-лимеразу и запускает транскрипцию. FRB — РКВР12-рапами-цин-связывающий участок РКВР12-рапамицин-ассоциирован-ного белка.
+'''''Описание к рисунок 5.6.''' Регуляция экспрессии гена с помощью сиролимуса (рапамицина). В верхней части рисунка показаны: 1) вектор, содержащий нужный трансген, транскрипция которого контролируется промотором, 2) химерный белок, состоящий из ДН К-связывающего участка фактора транскрипции и FKBP12 (см. текст), 3) химерный белок, состоящий из активирующего транскрипцию участка фактора транскрипции и FKBP12-panaмицин-связывающего участка РКВР12-рапамицин-ассоциированного белка (см. текст), 4) сиролимус. Сиролимус обеспечивает сборку фактора транскрипции, который активирует РНК-полимеразу и запускает транскрипцию. FRB — РКВР12-рапамицин-связывающий участок РКВР12-рапамицин-ассоциированного белка.''
 === Другие факторы роста и гормоны ===